Nội dung bài viết Quy trình chuyển gen:
1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn. Phân lập gen cần chuyển từ tế bào cho (người) 2. Enzym điều khiển đầu dính DNA Gen cần chuyển từ tế bào cho 3. 2 loại hỗn hợp DNA + Plasmid để nối bổ sung II – 1. Tạo hỗn hợp DNA tái tổ hợp trong bộ gen Kỹ thuật để mang gen từ tế bào này sang tế bào khác; Phải sử dụng một phân tử DNA đặc biệt gọi là bộ chuyển đổi. Kỹ thuật chèn gen cần thay đổi trong quá trình truyền máu được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. DNA tái tổ hợp là phân tử DNA nhỏ được lắp ráp từ các đoạn DNA thu được từ các nguồn khác nhau (bao gồm cả đầu dò và gen cần thay thế). Sinh học phân tử đã khám phá và hiểu rõ cơ chế hoạt động của nhiều loại enzym. Do đó, các nhà khoa học đã sử dụng chúng như những công cụ hữu ích trong việc cắt (dùng enzym giới hạn), nối (dùng ligase) để tạo ra ADN tái tổ hợp. 4. Enzim gắn photpho Diester ADN tái tổ hợp – gen cần chuyển 5. Chuyển ADN tái tổ hợp sang tế bào nhận 6. Tế bào vi khuẩn sinh sản tạo ra dòng tế bào mang bộ gen người Hình 25.1. Sơ đồ chuyển gen bằng ADN plasmid của thể thực khuẩn Enzyme cắt thể thực khuẩn Lambda 4. Chèn gen cần chuyển vào ADN tái tổ hợp vào phần đầu của thể thực khuẩn lambda.
Enzyme cắt giới hạn còn được gọi là enzyme cắt giới hạn. Mỗi enzyme cắt giới hạn cắt hai sợi đơn của phân tử DNA tại các vị trí nucleotide cụ thể. Các giai đoạn này được gọi là trình tự xác thực. Kết quả là kết thúc dính. Hình 25.1 là sơ đồ chuyển gen nhờ plasmit. Cắt ADN của tế bào cho và ADN của plasmit bằng cùng một loại enzim cắt giới hạn. Kết quả là sẽ có các nút dính trong cùng một hàng. Khi đoạn DNA của tế bào cho được trộn lẫn với DNA plasmid cắt mở, các đầu dính sẽ bổ sung cho nhau. Enzyme ligase hình thành liên kết phosphodiester làm cho DNA không thể phá vỡ. Plasmid mang gen ngoại lai được gọi là DNA tái tổ hợp. Các đối tượng hoặc vectơ chuyển gen được sử dụng để chuyển một gen mong muốn từ sinh vật này sang sinh vật khác. Vectơ chuyển gen là một phân tử ADN có khả năng tự sao chép, độc lập với tế bào và mang gen cần chuyển nạp. Có mấy loại vectơ chuyển gen: – Plasmid, ADN dạng vòng, sợi kép, nằm trong tế bào chất của vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn chứa hàng chục plasmid. Vectơ chuyển gen cũng có thể là phage lambdophilic (bac A), một loại virut lây nhiễm vi khuẩn (Hình 25.2) và một đoạn ADN của tế bào cho (gen cần chuyển) được tích hợp vào ADN của nó để tạo thành ADN tái tổ hợp . . Hình 25.2. Sơ đồ chuyển gen sử dụng thể thực khuẩn a) DNA của thể thực khuẩn; b) ADN bị cắt thành hai đoạn; c) gen được cấy (gen ngoại lai); d) tạo ra DNA tái tổ hợp; E) Thể thực khuẩn chứa ADN tái tổ hợp.
2. Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận Phương pháp truyền: Để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào, các nhà khoa học có thể dùng muối CaCl hoặc dùng xung điện để kéo căng màng sinh chất của tế bào. Khi đó, phân tử ADN tái tổ hợp có thể dễ dàng đi qua màng vào bên trong tế bào. Virus lây nhiễm vi khuẩn khi chúng xâm nhập vào tế bào vật chủ mang gen cần sửa đổi (gọi là sự tải nạp của vi khuẩn. Sau khi được chuyển vào tế bào vật chủ, ADN tái tổ hợp kiểm soát quá trình tổng hợp một loại protein cụ thể do nó mã hóa. 3. Các tế bào nhân bản chứa ADN tái tổ hợp được xác định Tế bào vi khuẩn nào đã nhận ADN tái tổ hợp Để phát hiện, các nhà khoa học phải chọn thể truyền có chứa các gen đánh dấu hoặc gen đánh dấu ổn định, giúp dễ dàng phát hiện sự có mặt của ADN tái tổ hợp, chẳng hạn tế bào nhận là loại nhạy cảm với dược chất, kháng sinh (ví dụ như môi trường nuôi cấy tetracycline), tất cả các tế bào không chứa DNA tái tổ hợp sẽ chết.Bình nuôi cấy chỉ chứa các tế bào chứa DNA tái tổ hợp.n
